Organoides que imitan la corteza cerebral humana en el desarrollo y la enfermedad

29. Junio 2022

Las células de la "glía radial externa" son células madre del sistema nervioso que son fundamentales para el desarrollo de la corteza humana y han sido difíciles de producir en el laboratorio. Ahora, un equipo de investigadores del Instituto Max Planck de Genética Molecular logró generar organoides cerebrales que se enriquecen con estas células madre al refinar y estandarizar los protocolos existentes para estos mini-órganos.

Los organoides son cultivos celulares tridimensionales avanzados que forman versiones en miniatura de tejidos como el hígado, el intestino, el cerebro o ciertos tipos de cáncer, y son muy prometedores para la ciencia. Permiten la investigación a gran escala sobre el desarrollo, la enfermedad y las terapias futuras sin la necesidad de depender de un organismo completo. Pero todavía hay muchos obstáculos que superar hasta que un organoide sea lo suficientemente similar a un órgano real o parte de él.



Organoide cortical humano bajo el microscopio, teñido con colorantes fluorescentes. Estos "mini cerebros" se han hecho con células iPS a través de la inhibición corta de tres vías de desarrollo (denominada triple inhibición, Triple-i). La tinción de color azul es evidencia del enriquecimiento de las células externas de la glía radial.


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Organoide cortical humano bajo el microscopio, teñido con colorantes fluorescentes. Estos "mini cerebros" se han hecho con células iPS a través de la inhibición corta de tres vías de desarrollo (denominada triple inhibición, Triple-i). La tinción de color azul es evidencia del enriquecimiento de las células externas de la glía radial.


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En un artículo publicado en Nature Cell Biology, los científicos del Instituto Max Planck de Genética Molecular (MPIMG) informan que lograron cultivar organoides que se asemejan a la corteza cerebral humana con una consistencia y calidad sin precedentes. Prepararon células madre con un cóctel de tres pociones químicas durante un corto tiempo en una etapa muy temprana de su desarrollo. Esto instruyó a las células madre a formar agregados celulares durante las siguientes semanas que imitan anatómicamente la estratificación de la corteza humana. Entre esas capas crecieron células de glía radial externa, células madre especializadas que son esenciales para la expansión característica de los hemisferios cerebrales en humanos y simios. Esta es la primera vez que estas células han sido generadas, enriquecidas y caracterizadas con éxito en un sistema de cultivo celular.

"Sorprendentemente, es bastante fácil generar organoides cerebrales en el laboratorio por muchos métodos", dice Yechiel Elkabetz, líder del grupo de investigación en el MPIMG en Berlín, Alemania y anteriormente en la Universidad de Tel Aviv, Israel, quien realizó esta investigación. "Pero es difícil hacerlo bien. El desafío es crear un cultivo de células madre del sistema nervioso muy puro al principio y persuadir a estas células para que construyan organoides neurales de múltiples capas con los tipos de células correctos en los lugares correctos".

Los organoides neurales se pueden cultivar a partir de muestras de tejido, células madre embrionarias o incluso células madre pluripotentes inducidas, células corporales maduras que han sido programadas para transformarse de nuevo a la etapa de células madre embrionarias. Pero los resultados han sido muy inconsistentes en términos de procedimientos, material de origen y también entre organoides en el mismo plato.

"No solo los cultivos de organoides neurales resultan ser muy heterogéneos, sino que también las células madre que construyen estos organoides están cambiando con el tiempo", explica Sneha Arora, investigadora del laboratorio de Elkabetz y una de las autoras principales del artículo. Ella señala que hay bastantes protocolos ampliamente utilizados que simplemente "dejan" a las células para instruirse a sí mismas con solo orientación parcial o nula. "Si empleas constructores para construir una serie de casas sin ninguna o con instrucciones incompletas, terminarás con un edificio diferente cada vez".


Sección de una imagen microscopía del organoide con las capas típicas de la corteza cerebral visibles.

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Sección de una imagen microscopía del organoide con las capas típicas de la corteza cerebral visibles.

Encontrar las instrucciones correctas para los constructores del cerebro ha sido un desafío para los laboratorios de todo el mundo durante una década, y surgieron una variedad de protocolos y procedimientos, cada uno con diferentes resultados. Entonces, ¿cómo puedes saber qué método es el correcto? Elkabetz y sus colegas se asociaron con varios investigadores del MPIMG para estandarizar las técnicas existentes y desarrollar el protocolo más avanzado para generar organoides cerebrales que se asemejen a la corteza cerebral humana de la mejor manera posible.

Al igual que otros grupos anteriores, los investigadores utilizaron inhibidores, medicamentos químicos que le dicen a la célula en desarrollo "en qué no transformarse", para que eventualmente elijan la ruta correcta. Descubrieron que tres vías de señalización diferentes necesitaban ser bloqueadas para persuadir a las células madre de que se convirtieran en células corticales unas semanas más tarde. "Educamos e implementamos los mejores constructores para nuestros organoides. Una vez que se crean las células de partida y tienen sus instrucciones incorporadas, no hacemos mucho más que eso, y el organoide se ensambla, esta vez correctamente, lo que funciona muy bien ", dice Arora.

"Fue un punto clave combinar la inhibición de Dual-SMAD y WNT, que se han utilizado principalmente por separado antes", dice Arora. Según ella, el momento y la dosificación de los medicamentos es crucial. "Durante la fase muy temprana y durante solo ocho días, generamos una población inicial de células muy homogénea. Estos resultaron ser los mejores bloques de construcción iniciales para todo el órgano".

Un protocolo unificador

Comenzando con un panel de diferentes líneas celulares y enfoques metódicos que se compararon en paralelo, los investigadores finalmente lograron generar consistentemente organoides corticales con una precisión sin precedentes. "Uno de los logros importantes de nuestro estudio es que pudimos reproducir la diversidad celular en todos y cada uno de los organoides", dice Daniel Rosebrock, investigador computacional en el laboratorio Elkabetz y el Departamento de Biología Molecular Computacional del MPIMG y autor principal de este trabajo interdisciplinario. "Si bien cada organoide fue capaz de retener los muchos tipos de células diferentes, hubo poca diferencia entre los organoides individuales". Los investigadores confirmaron esto en tinciones de tejido y mediante la secuenciación del ARN de las células individuales.

"En todos los protocolos y líneas, los organoides hechos con nuestro nuevo protocolo exhibieron los niveles más altos y consistentes de identidad cortical", dice Rosebrock. Esto también tiene implicaciones en los modelos de enfermedades organoides: "Aprendimos que el método de derivación determina si un fenotipo de enfermedad en un modelo organoide es significativo en absoluto".

Varias enfermedades del neurodesarrollo como la microcefalia se han modelado en organoides. Son causadas por interrupciones del proceso altamente regulado del desarrollo cortical cerebral. Las células progenitoras neurales tempranas tienen que encontrar un equilibrio entre un grado suficiente de autorrenovación, por un lado, y la capacidad de diferenciación, por el otro. Por lo tanto, es imperativo investigar estos procesos en el modelado de enfermedades.

Avance en el cultivo celular

Los científicos demostraron que sus organoides desarrollan células oRG, el tipo especial de células madre neurales que se sabe que desempeñan un papel crítico en el desarrollo del cerebro en humanos y simios. Son responsables de los enormes hemisferios cerebrales corticales en los primates.

"Nuestras células oRG se convierten gradualmente en las células madre más importantes de nuestro cerebro a medida que se desarrolla", dice Elkabetz. Después de un cierto período de crecimiento, estas células comprenden una importante población de células madre en el cerebro. "Por supuesto, los cerebros en desarrollo de primates y humanos en particular rara vez son accesibles para los investigadores y, por lo tanto, las células oRG cultivadas son una gran oportunidad para la investigación del desarrollo y para futuras aplicaciones terapéuticas".

Después de 50 días de crecimiento, los organoides del equipo se enriquecen considerablemente con este tipo de células madre. "Hemos desarrollado un método para generar y enriquecer células oRG en el plato de una manera robusta y consistente que no se ha descrito anteriormente", dice Elkabetz. "Este es un logro bastante sustancial. Finalmente podremos hacer modelos más significativos de enfermedades como la microcefalia que estén más cerca de la verdad de un órgano real".

Los hallazgos proporcionan una plataforma sobre la que construir, para futuras aplicaciones en investigación básica, pruebas farmacológicas o en la clínica, concluye el científico: "Proporcionamos una base sólida para la generación de células madre neurales que son capaces de formar la rica diversidad celular, que es el sello distintivo de la corteza. Creemos que esto conducirá a modelos de enfermedades organoides que avanzarán en la investigación de manera importante".

 
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